由于力量过于悬殊，皖南新四军在奋战七天七夜后，终于因弹尽粮绝而失败。奉命同国民党军队谈判的军长叶挺被扣；项英、袁国平、周子昆等遇难。一月十五日，中共中央召开政治局会议，检讨新四军失败的原因，毛泽东指出：从我们自己方面来说，首先是由于项英、袁国平等没有反磨擦的思想准备，其次是指挥上的错误。他提出：袁、项的错误须立即宣布，如何处置交七大解决。会议通过了毛泽东起草的《中央关于项袁错误的决定》。在这次会上毛泽东提出：我们要实行全国的政治反攻，像我们前次反对第一次反共高潮时一样非常强硬的态度，只有不怕决裂，才能打退国民党的进攻。他又说：左派主张我们马上与国民党大打起来，我们也不能实行这种政策。（55）
一月十七日，蒋介石发布取消新四军的命令，把叶挺交付军事法庭审判，将反共高潮推到顶点。国共关系已处于异常紧张的状态。这时，毛泽东反而更加冷静。他接受了刘少奇的建议，提出“在政治上取猛烈攻势，而在军事上暂时还只能取守势”。（56）
一月二十日，中共中央召开政治局会议，讨论对付时局的办法。毛泽东指出，要挽救时局，实现好转，必须由国民党当局取消一月十七日的命令。会议决定：成立中央军委主席团，由毛泽东、朱德、彭德怀、周恩来、王稼祥组成，军委实际工作由主席团办理。驻国民党统治区的各办事处实行撤退。
当天，根据政治局会议决定，在延安发布了毛泽东为中共中央革命军事委员会起草的重建新四军军部的命令，任命陈毅为新四军代理军长，张云逸为副军长，刘少奇为政治委员，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。随后，新四军军部在苏北盐城成立，整编全军为七个师和七个独立旅，共九万多人，在大江南北坚持敌后抗战。
同时，也根据政治局会议的决定，毛泽东以中共中央革命军事委员会发言人的身分对新华社记者发表关于皖南事变的谈话。他指出：“此次皖南反共事变，酝酿已久。目前的发展，不过是全国性突然事变的开端而已。”“特别是一月十七日的命令，包含着严重的政治意义。因为发令者敢于公开发此反革命命令，冒天下之大不韪，必已具有全面破裂和彻底投降的决心。”他说：“目前全国人民的紧急任务，在于以最大的警惕性，注视事变的发展，准备着对付任何黑暗的反动局面，绝对不能粗心大意。”
那么，事情是不是已经到了非决裂不可的地步呢？毛泽东提出了解决皖南事变的十二条办法：第一、悬崖勒马，停止挑衅；第二、取消一月十七日的反动命令，并宣布自己是完全错了；第三、惩办皖南事变的祸首何应钦、顾祝同、上官云相三人；第四、恢复叶挺自由，继续充当新四军军长；第五、交还皖南新四军全部人枪；第六、抚恤皖南新四军全部伤亡将士；第七、撤退华中的“剿共”军；第八、平毁西北的封锁线；第九、释放全国一切被捕的爱国政治犯；第十、废止一党专政，实行民主政治；第十一、实行三民主义，服从《总理遗嘱》；第十二、逮捕各亲日派首领，交付国法审判。
最后，毛泽东指出：“他们已经杀了第一刀，这个伤痕是很深重的。他们如果还为前途着想，他们就应该自己出来医治这个伤痕。”他说：“如能实行以上十二条，则事态自然平复，我们共产党和全国人民，必不过为已甚。否则，‘吾恐季孙之忧，不在颛臾，而在萧墙之内’，反动派必然是搬起石头打他们自己的脚，那时我们就爱莫能助了。”（57）
毛泽东的这个谈话和他提出的解决办法，合情合理，引起重大反响，不仅“全党一致拥护，情绪异常兴奋”（58），而且深受党外人士的好评。国民党爱国民主人士宋庆龄、何香凝、柳亚子、彭泽民、陈友仁等联名致信蒋介石，谴责政府当局对新四军的迫害，要求释放叶挺；从前怕共产党过于强硬会引起破裂的民族资产阶级代表陈嘉庚、张一麐等仗义执言；冯玉祥、于右任、孙科等也对蒋介石表示不满，冯玉祥说：“只有共产党的十二条，国事才能解决。”（59）这件事，在国际上也引起广泛重视。斯特朗、斯诺等在美国报纸上发表报道和评论，向世界披露皖南事变的真相。英、美、苏等国都不支持蒋介石的作法，对他形成很大压力。
蒋介石突然发现自己陷入了内外交困、空前孤立的狼狈境地，这是他根本没有料想到的。更加出乎他意外的是，连日本军队也没有因为他发动反共内战而停止进攻。一月下旬，日军发动豫南战役，将国民党军队十五万人包围在平汉铁路以东，两军发生激战。毛泽东评论说：这对蒋介石“是一瓢极大的冷水，把他的全部的幻想打破了”。（60）毛泽东判断：“他们非求得个妥协办法不可，敌人攻得如此之急，一一七命令如此丧失人心，他的计划全部破产，参政会又快要开了，非想个妥协办法，更加于他不利。”（61）
毛泽东的判断完全符合实际。在中国共产党的强大政治攻势下，蒋介石几次派张冲、张治中找周恩来商量妥协办法，并且批准叶剑英回到延安。二月二日，叶剑英到达延安，带来周恩来给毛泽东的信件和他为抗议国民党发动皖南事变而写下的“千古奇冤，江南一叶，同室操戈，相煎何急”的题词。毛泽东看后感到“欣慰之至”，“为之神王”。他在杨家岭住所同叶剑英畅谈了五个小时。
这时，国内政治斗争的焦点已转到中共方面的参政员是否出席第二届国民参政会的问题上。第二届国民参政会参政员的名单是在皖南事变前夕公布的。中共方面的参政员仍是毛泽东、董必武、邓颖超等七人。由于皖南事变的发生，各民主党派希望通过这个会议来缓解一下国共矛盾，纷纷表示这次会议中共方面的代表必不可少。美国总统罗斯福的代表居里也表示：留在重庆，专等观光国民参政会。这给蒋介石造成很大压力，为了摆脱困境，必须争取中共方面的参政员出席会议。
中共代表是否出席这次参政会呢？毛泽东同周恩来电报往来，反复协商，认为不能无条件出席。毛泽东指出：蒋介石“从来没有如现在这样受内外责难之甚”。“目前形势是有了变化的，一月十七日以前，他是进攻的，我是防御的，十七日以后反过来了，他已处于防御地位，我之最大胜利在此。”“目前是迫蒋对我让步时期。非我对蒋让步时期，熬过目前一关，就好办了。”（62）蒋介石既要中共参政员出席会议，又不肯答应中国共产党提出的十二条。为了打破僵局，经毛泽东修改审定，又提出中共中央的临时解决办法“新十二条”。它的主要内容是：要求国民党方面立即停止在全国的反共军事进攻；释放叶挺和皖南所有被捕干部，交还所有人、枪；成立各党派联合会；承认边区的合法地位，承认敌后抗日政权等。这个“新十二条”，在国民参政会开幕第二天的三月二日清晨用公函形式送去。但蒋介石仍不肯接受。同一天，毛泽东致电周恩来，根据中央书记处会议讨论的意见，指出：“蒋介石正发动一切压力迫我屈服，我若出席则过去有理有利的政治攻势完全崩溃，立场全失，对我一切条件他可完全置之不理，一切文章不能做了，因此，决不能无条件出席。”毛泽东分析：中共参政员不出席会议，蒋介石也无可奈何。因为：第一、皖南事变蒋错了，举国皆知；中共以不出席抗议并没有错；第二、中共已提出让步条件（临时办法），蒋不答应，其曲在彼；第三、若蒋由此发动更大破裂行动，其曲更在彼，更于彼不利；第四、国际形势对蒋不利；第五、国内形势，彼方对我绝无办法，我毫无所惧。“只要熬过目前一关，就有好转可能，在半年内如能解决善后条件，我仍准备出席九月间的二次参政会。”（63）
经过这场斗争，蒋介石在参政会的讲话中虽然继续攻击中共，但不得不宣称：“以后亦决无‘剿共’的军事，这是本人可负责声明而向贵会保证的”。（64）毛泽东评论蒋介石的这个讲话是“一种阿Q主义，骂我一顿，他有面子，却借此收兵”。（65）它实际上标志着蒋介石发动的这次规模更大的反共高潮又被击退了。这以后，国共关系又逐渐走向一定程度的缓和。
三月十八日，毛泽东为中共中央起草的党内指示中指出：“这次斗争表现了国民党地位的降低和共产党地位的提高，形成了国共力量对比发生某种变化的关键。”“我党在这次反共高潮开始时采取顾全大局委曲求全的退让政策（去年十一月九日的电报），取得了广大人民的同情，在皖南事变后转入猛烈的反攻（两个十二条，拒绝出席参政会和全国的抗议运动），也为全国人民所赞助。我们这种有理、有利、有节的政策，对于打退这次反共高潮，是完全必要的，且已收到成效。”（66）
为了总结打退这次斗争的丰富经验，以便更深刻地了解中国的实际国情，更自觉地在中国的复杂环境中进行有效的斗争，五月八日，毛泽东为中共中央起草了一份党内指示。这份党内指示，在收入《毛泽东选集》时，题目是《关于打退第二次反共高潮的总结》。他写道：
“在中国两大矛盾中间，中日民族间的矛盾依然是基本的，国内阶级间的矛盾依然处在从属的地位。一个民族敌人深入国土这一事实，起着决定一切的作用。只要中日矛盾继续尖锐地存在，即使大地主大资产阶级全部地叛变投降，也决不能造成一九二七年的形势，重演四一二事变和马日事变。上次反共高潮曾被一部分同志估计为马日事变，这次反共高潮又被估计为四一二事变和马日事变，但是客观事实却证明了这种估计是不正确的。这些同志的错误，在于忘记了民族矛盾是基本矛盾这一点。”
“在这种情况之下，指导着国民党政府全部政策的英�